Методы генетики. Медицинская биология Цитогенетический метод и другие

Для определения изменений в хромосомном аппарате, связанных с неправильным набором Х-хромосом, часто применяют относительно простой, но довольно информативный метод исследования полового хроматина. Для этого шпателем делают легкий соскоб со слизистой внутренней поверхности щеки, который наносят на стекло. Попавшие туда слущенные клетки соответствующим образом обрабатывают и рассматривают под микроскопом. В эпителиальных клетках женщин обычно обнаруживается одно темное пятнышко - тельце Барра. У мужчин, которые имеют только одну Х-хромосому, его нет. Отсутствует тельце Барра и у женщин с синдромом Шерешевского-Тернера. При наличии в кариотипе женщины двух дополнительных хромосом (при трисомии-Х) в клетках таких телец два и т. д.

Однако диагноз хромосомного заболевания считается установленным только в случае, если проведено кариологическое обследование, то есть изучен кариотип. Определение кариотипа трудоемко и дорого.

Показаниями для кариотипирования являются:

Выявленная патология полового хроматина;
наличие у больного множественных пороков развития;
задержка психоречевого и умственного развития в сочетании с повышением числа микроаномалий;
повторные самопроизвольные аборты, мертворождения, рождение детей с пороками развития, хромосомной патологией (во всех этих случаях обследуется семейная пара, то есть обязательно муж и жена);
возраст беременной 35 лет и старше.

Однако при таком подходе оставался недифференцированным ряд сложных случаев хромосомной патологии, таких как добавочная маркерная хромосома, сложные случаи хромосомного мозаицизма (в организме больного имеется несколько клонов клеток - нормальных и аномальных). На основе классических методов дифференцированного окрашивания были разработаны микроцитогенетические методы. Они основаны на анализе хромосом на ранних стадиях их деления - прометафазе и профазе. С помощью микроцитогенетичес-ких методов удалось выявлять до 2000-3000 дискретных сегментов на хромосомах, в отличие от классического анализа, при котором выявлялось до 300-400 сегментов.
Эти методы с использованием светового микроскопа широко применяются в практике цитогенетических лабораторий и позволяют выявлять более 100 хромосомных синдромов.Методы FISH-диагностики стали широко использовать для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, если например у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, к ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис . Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, пожалуй, самым точным и чувствительным методом диагностики инфекционных заболеваний.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК . В результате нарабатываются количества ДНК , достаточные для визуальной детекции. Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Для определения генетического дефекта нужно знать, какой из генов затронут и где расположен этот ген. Мощным инструментом для определения пораженных генов и скрининга популяции людей на наличие измененного гена считается анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Широкое использование различных рестрикционных эндонуклеаз для анализа хромосомной ДНК выявило огромную вариабельность генома человека. Даже небольшие изменения в кодирующих и регуляторных областях структурных генов могут привести к прекращению синтеза определённого белка или к потере его функции в организме человека, что, как правило, сказывается на фенотипе пациента. Однако приблизительно 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, которые более изменчивы и содержат множество так называемых нейтральных мутаций, или полиморфизмов, и не имеют фенотипического выражения. Такие полиморфные участки (локусы) используются в диагностике наследственных заболеваний в качестве генетических маркёров. Полиморфные локусы присутствуют во всех хромосомах и сцеплены с определённым участком

гена. Определив локализацию полиморфного локуса, можно установить, с каким геном связана мутация, вызвавшая заболевание у пациента.

Для выделения полиморфных участков ДНК применяются бактериальные ферменты - рестриктазы, продуктом которых являются сайты рестрикции. Спонтанные мутации, возникающие в полиморфных сайтах, делают их резистентными или, наоборот, чувствительными к действию специфичной рестриктазы.

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть обнаружена по изменению длины рестрикцированных фрагментов ДНК, путём разделения их с использованием электрофореза и последующей гибридизации со специфическими ДНК-зондами. При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах будет выявляться один крупный фрагмент, а при её наличии будет присутствовать меньший по размеру фрагмент. Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных ло-кусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надёжно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству. Таким образом, при исследовании ДНК пациентов, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофоре-грамме будут выявляться короткие фрагменты ДНК. У пациентов, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будут выявляться фрагменты большей длины, а у гетерозиготных - короткие и длинные фрагменты.

Цитогенетический метод изучения наследственности человека представляет собой микроскопический анализ хромосом. Он стал широко применяться с начала 20-х годов 20-го столетия. С помощью метода осуществляется исследование морфологии человеческих хромосом и их подсчет. Его также используют для культивирования лейкоцитов, чтобы получить метафазные пластинки. Далее рассмотрим подробнее, что собой представляет цитогенетический метод изучения наследственности человека.

Общие сведения

Цитогенетический метод исследования генетики человека, его развитие и становление связаны с такими учеными, как Леван и Тио. Они в 1956 году первыми установили точное количество хромосом у людей. Их оказалось не 48, как думали ранее, а 46. Именно это и положило начало исследованию мейотических и митотических хромосом человека. В 1959-м году французскими учеными Готье, Тюрпеном и Леженом была установлена природа синдрома Дауна. Используя цитогенетический метод, они выявили, что болезнь имеет хромосомную этиологию. В последующие годы было описано еще множество патологий, часто встречающихся у людей и имеющих ту же природу. Сегодня цитогенетический метод изучения наследственности используется при диагностировании, составлении хромосомных карт, анализа мутационного процесса и решения прочих важных проблем. В 1960 году в США была разработана 1 Международная классификация. В основе нее использовались размеры хромосом, а также расположение центромеры - первичной перетяжки.

Анализ кариотипа

Оценка и выявление аномалий проводится в несколько приемов. Для выполнения анализа необходим фрагмент периферической крови больного объемом около 1-2 литров. Этапы цитогенетического метода при анализе кариотипа следующие:

Культивирование лимфоцитов.
Окраска.
Микроскопический анализ.

Культивирование лимфоцитов

Эта процедура необходима для стимулирования их деления. Это связано с тем, что возможности цитогенетического метода напрямую зависят от количества клеток, которые находятся на стадии метафазы, в тот момент когда хромосомы собраны наиболее компактно. Длительность культивирования, как правило, 72 часа. Увеличению числа метафазных клеток способствует введение в завершении процесса колхицина. Он приостанавливает на стадии метафазы деление, разрушает его веретено и повышает конденсацию хромосом. Затем клетки перемещаются в гипотонический раствор. Он провоцирует разрыв ядерной оболочки и свободное движение хромосом в цитоплазме.

Окрашивание

На этой стадии процесса клетки фиксируются с помощью уксусной к-ты и этанола в пропорции 1:3. Далее суспензию помещают на предметные стекла и сушат. В соответствии с целями анализа применяются разные приемы дифференциального окрашивания. Длительность процедуры - несколько минут. Окрашивание приводит к возникновению рисунка с поперечной исчерченностью, специфичного для каждой из хромосом.

Микроскопический анализ

Самым трудоемким процессом считается световое микроскопирование. Для его выполнения необходима высокая квалификация специалиста. Чтобы выявить хромосомные аномалии, следует проанализировать не меньше 30-ти пластинок. Весьма результативными считаются компьютерные методы исследования.

Разрешающая способность

Молекулярно-цитогенетический метод может применяться для анализа хромосом, отдельные сегменты которых могут иметь разную окраску. При этом кариотипы в целом похожи на красочные фантастические удивительные картины. Внедрены и активно применяются методы, с помощью которых осуществляется окрашивание хромосом в состоянии покоя, когда они максимально растянуты. Использование таких приемов позволяет идентифицировать сегменты, размер которых порядка 50 килобаз.

Развитие отрасли

В течение последних нескольких лет отмечается достаточно активный сдвиг в становлении области молекулярной биологии. Это прежде всего обуславливается работами по расшифровке генома людей, выполненными в рамках государственных и международных программ "Совокупность человеческих генов". В результате трудов были не только получены обширные по своему объему сведения по строению дезоксирибонуклеиновой кислоты. Были также проведены исследования современных технологий анализа, способов обработки больших объемов информации, созданы и сохранены информационные базы данных. На основании этих материалов сформировалось новое направление - молекулярная генетика. Она позволила обнаружить многочисленные специфичности в функциях хромосомного набора. Цитогенетический метод изучения используется для выявления новых элементов и звеньев, осуществления дешифровки мутации при наличии солидного числа врожденных заболеваний.

Специализированные области

Как видно, цитогенетический метод позволил решить существенные проблемы. В связи с этим стали появляться специализированные направления. В частности, сформировались такие области, как функциональная молекулярная генетика, врачебная, этническая геномика (этногеномика), сравнительная наука, исследующая гены и геномы живых существ и прочие.

Этногеномика

Основной ее задачей является анализ генетического многообразия в разнообразии генов отдельных территориальных общностей, наций, групп. В данном случае необходимо подчеркнуть принципиально важную идею. Благодаря этногеномике генетическая хромосомная механика стала влиять не только на имеющие определенное родство виды науки о терапии и жизнедеятельности, но и на достаточно отчужденные области, как, например, история.

Вариабельность

В процессе декодирования хромосомного набора, в то время как уже выявлены главные особенности в его конструкции, ученым стала ясна серьезность многообразия генома. Анализ вариабельности позволяет решить разнообразные проблемы, как практического, так и теоретического характера. Особое значение цитогенетический метод имеет при оценке развития человечества, принимая во внимание происхождение, цикл перемещения, формирование, родство и взаимодействие разных видов.

Анализ ДНК

Исследования дезоксирибонуклеиновой кислоты людей, населяющих планету сегодня, позволяют получить информацию о достаточно отдаленных явлениях и хронологических фактах, даже до самого момента появления человека. Так, к примеру, было выявлено, что в дезоксирибонуклеиновой кислоте вписано множество событий. Чтобы интерпретировать результаты этих исследований, необходимо рассматривать ДНК разных представителей всех общин, определяя степень и хромосомного родства.

Патологии

Причины многих заболеваний, к примеру, синдром Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера, Дауна и прочих, долгое время оставались невыясненными. Но использование цитологического метода позволило обнаружить аномалии хромосом. Мужчины, страдающие синдромом Клайнфельтера, отличаются недоразвитостью гонад, умственной отсталостью, дегенерацией семенных канальцев, непропорциональностью конечностей и прочим. У женщин диагностируется болезнь Шерешевского-Тернера. Синдром проявляется в отсутствии менструаций и позднем половом созревании, недоразвитости гонад, небольшом росте, бесплодии и прочих признаках. В результате исследований было выявлено нерасхождение половых хромосом в процессе формирования родительских гамет. Дальнейший анализ показал, что следствием этого являются различные аномалии. Отмечается, в частности, полисомия. Например, мужчины могут иметь набор XX Y, XXX Y, ХХХХ Y, женщины же - XXX, ХХХХ. Существует особенность значения половых хромосом при детерминации человеческого пола при их нерасхождении. Так, в отличие от дрозофилы, она проявляется в том, что XX Y определяет исключительно мужской, а Х0 - женский пол. Вместе с этим увеличение количества хромосом Х при сочетании с одной Y только усиливает болезнь Клайнфельтера. Полисомия либо трисомия у женщин также является провоцирующим фактором для развития патологий, сходных с синдромом Шерешевского-Тернера.

В заключение

Патологии, спровоцированные нарушениями в нормальном количестве половых хромосом, обнаруживаются анализом хроматина. При нормальном наборе у мужчин он в клетках не обнаруживается. У здоровых женщин хроматин выявляется в виде 1 тельца. На фоне полисмии у женщин и мужчин число телец хроматина всегда меньше количества хромосом Х на единицу. Для каждой такой зиготы генетическая активность присутствует только у одного структурного элемента. Остальные же хромосомы Х в виде полового хроматина принимают гетеропикнотическое состояние. Причины данной закономерности сегодня выявлены не до конца. Тем не менее предполагается, что она обуславливается нивелированием активности генов в половых хромосомах гомо- и гетерогаметного пола. Кроме описанных выше, патологии могут возникать вследствие нерасхождения аутосом, а также благодаря разнообразным перестройкам типа делеций, транслокаций и прочих. С хромосомными аномалиями врожденного типа связано множество болезней. Именно поэтому цитогенетический метод имеет особое значение в их выявлении.

Наследственность человека трудно поддается изучению:

Примерно одинаковая продолжительность жизни исследователя (врача) и пациента, максимально может изучит 3-4 поколения в семье,

Поздно наступающая половая зрелость человека и малое число потомков,

Большое число хромосом и генов,

Отсутствие записанных родословных в семье,

Гибридологический метод применять нельзя.

Существует ряд методов, которые позволяют проследить наследование признаков. Это позволяет установить диагноз, бороться с болезнями, провести консультацию лицам, нуждающимся в ней.

Клинико- генеалогический

Биохимический

Цитогенетический

Близнецовый

Популяционно-статестический

Имунно-генетический

Близнецовый метод.

МZ (ОБ) однояйцевые.

1 яйцеклетка + 1 сперматозоид → зигота, которая далее на ранних стадиях делиться на 2 эмбриона.

Всегда одного пола (генетически эдентичны). Различия между ними зависят в основном от действия внешних факторов.

2 яйцеклетка + 2 сперматозоида = → 2 зиготы.

DZ (РБ). Они сходны между собой как 2 сестры или 2 брата, рождённые порознь. Могут быть и разнополые или однополые. Различия зависят от наследственности и от средовых факторов.

Метод позволяет разграничить роль наследственности и среды в разнообразии признаков человека.

Если возникновение признака (или его отсутствие) в значительной степени зависит от генетической конструкции тогда у ОБ совпадение наблюдается чаще.

Внутрипарное сходство близнецов (похожесть) называется конкорданность, у ОБ она > чем РБ.

(псориаз МЗ 61 % РБ 13%) . Шизофрения 69% (10%). Депрессия (психоз) 96% (19%).

90-100% оттенок кожи, форма носа, оттенок радужки, у ОБ

Группа крови, слюны, резусу у ОБ- 100%

81-90% дактилоскоп. Узору у ОБ.

Сущность метода: изучения внутрипарного сходства близнецов, при сравнении которых можно судить о влиянии среды и наследственности на развитие того или иного признака (воздействие хим. в-в, лекарств…).

Цитогенетический метод.

Это микроскопический анализ хромосом (кариотипа) позволяет выявить числовые и структурные изменения хромосом (перестройки, поломки и др..

Хромосомы изучают в делящихся клетках костного мозга, лимфоцитах крови, реже кожи, мышц.

Хромосомы можно изучать и будущего ребёнка (эмбриона): ворсины хориона, клетки плаценты, пуповинной крови, амниотической жидкости (околоплодных вод- метод амниоцентез).

Клетки отбирают, выращивают на питательной среде, добавляют колхитин. Он останавливает митоз на стадии метафазы. Микропрепараты обязательно окрашивают. Существует различные методики цитогенетической диагностики. Методом можно определять половой хроматин (тельце Барра)

Показания к методу:

У пробанда, его родителей или родственников при подозрении на хромосомную болезнь (уточнение диагноза)

При тяжёлых психических расстройствах

При первичной аменореи (отсутствие менструации) бесплодии

При спонтанных абортах, мёртворожденных

У детей с множественными пороками развития, не подходящими под какую либо болезнь.

При изучении мутагенного действия, каких либо факторов (лекарственные средства, наркотики, радиация…)

При проведении медико- генетического консультирования.

Метод приводит к более точной диагностики, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребёнка.

Цитогенетический метод

Основан на изучении хромосом человека в норме и при патологии. В норме кариотип человека включает 46 хромосом - 22 пары аутосом и две половые хромосомы. Использование данного метода позволило выявить группу болезней, связанных либо с изменением числа хромосом, либо с изменениями их структуры. Такие болезни получили название хромосомных.

Материалом для кариотипического анализа чаще всего являются лимфоциты крови. Кровь берется у взрослых из вены, у новорожденных - из пальца, мочки уха или пятки. Лимфоциты культивируются в особой питательной среде, в состав которой, в частности, добавлены вещества, «заставляющие» лимфоциты интенсивно делиться митозом. Через некоторое время в культуру клеток добавляют колхицин. Колхицин останавливает митоз на уровне метафазы. Именно во время метафазы хромосомы являются наиболее конденсированными. Далее клетки переносятся на предметные стекла, сушатся и окрашиваются различными красителями. Окраска может быть а) рутинной (хромосомы окрашиваются равномерно), б) дифференциальной (хромосомы приобретают поперечную исчерченность, причем каждая хромосома имеет индивидуальный рисунок). Рутинная окраска позволяет выявить геномные мутации, определить групповую принадлежность хромосомы, узнать, в какой группе изменилось число хромосом. Дифференциальная окраска позволяет выявить хромосомные мутации, определить хромосому до номера, выяснить вид хромосомной мутации.

В тех случаях, когда необходимо провести кариотипический анализ плода, для культивирования берутся клетки амниотической (околоплодной) жидкости - смесь фибробластоподобных и эпителиальных клеток.

К числу хромосомных заболеваний относятся: синдром Клайнфельтера, синдром Тернера-Шерешевского, синдром Дауна, синдром Патау, синдром Эдвардса и другие.

Больные с синдромом Клайнфельтера (47, ХХY) всегда мужчины. Они характеризуются недоразвитием половых желез, дегенерацией семенных канальцев, часто умственной отсталостью, высоким ростом (за счет непропорционально длинных ног).

Синдром Тернера-Шерешевского (45, Х0) наблюдается у женщин. Он проявляется в замедлении полового созревания, недоразвитии половых желез, аменорее (отсутствии менструаций), бесплодии. Женщины с синдромом Тернера-Шерешевского имеют малый рост, тело диспропорционально - более развита верхняя часть тела, плечи широкие, таз узкий - нижние конечности укорочены, шея короткая со складками, «монголоидный» разрез глаз и ряд других признаков.

Синдром Дауна - одна из самых часто встречающихся хромосомных болезней. Она развивается в результате трисомии по 21 хромосоме (47; 21, 21, 21). Болезнь легко диагностируется, так как имеет ряд характерных признаков: укороченные конечности, маленький череп, плоское, широкое переносье, узкие глазные щели с косым разрезом, наличие складки верхнего века, психическая отсталость. Часто наблюдаются и нарушения строения внутренних органов.

Хромосомные болезни возникают и в результате изменения самих хромосом. Так, делеция р-плеча аутосомы №5 приводит к развитию синдрома «крик кошки». У детей с этим синдромом нарушается строение гортани, и они в раннем детстве имеют своеобразный «мяукающий» тембр голоса. Кроме того, наблюдается отсталость психомоторного развития и слабоумие.

Чаще всего хромосомные болезни являются результатом мутаций, произошедших в половых клетках одного из родителей.

Биохимический метод

Позволяет обнаружить нарушения в обмене веществ, вызванные изменением генов и, как следствие, изменением активности различных ферментов. Наследственные болезни обмена веществ подразделяются на болезни углеводного обмена (сахарный диабет), обмена аминокислот, липидов, минералов и др.

Фенилкетонурия относится к болезням аминокислотного обмена. Блокируется превращение незаменимой аминокислоты фенилаланин в тирозин, при этом фенилаланин превращается в фенилпировиноградную кислоту, которая выводится с мочой. Заболевание приводит к быстрому развитию слабоумия у детей. Ранняя диагностика и диета позволяют приостановить развитие заболевания.

42. Пренатальная диагностика врожденных и наследственных болезней - это комплексная отрасль медицины, которая быстро развивается. Она использует и ультразвуковую диагностику (УЗИ), и оперативную технику (хорионбиопсию, амнио-и кордоцентез, биопсию мышц и кожи плода), и лабораторные методы (цитогенетические, биохимические, молекулярно-генетические).

Пренатальная диагностика имеет исключительно важное значение при медико-генетическом консультировании, поскольку она позволяет перейти от вероятного к однозначному прогнозированию здоровья ребенка в семьях с генетическими осложнениями. В настоящее время пренатальная диагностика осуществляется в I и II триместрах беременности, то есть в периоды, когда в случае выявления патологии еще можно прервать беременность. На сегодня возможна диагностика практически всех хромосомных синдромов и около 100 наследственных болезней, биохимический дефект при которых установлен достоверно.

Пренатальная диагностика - комплексная дородовая диагностика с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Позволяет обнаружить более 98 % плодов с синдромом Дауна (трисомия 21); трисомии 18 (известной как синдром Эдвардса) около 99,9 %; трисомии 13 (синдром Патау) около 99.9%, более 40 % нарушений развития сердца и др. В случае наличия у плода болезни родители при помощи врача-консультанта тщательно взвешивают возможности современной медицины и свои собственные в плане реабилитации ребёнка. В результате семья принимает решение о судьбе данного ребёнка и решает вопрос о продолжении вынашивания или о прерывании беременности.

К пренатальной диагностике относится и определение отцовства на ранних сроках беременности, а также определение пола плода.

Показания для пренатальной диагностики : наличие в семье наследственного заболевания; возраст матери старше 37 лет; носительство матерью гена Х-сцепленного рецессивного заболевания; наличие в прошлом спонтанных абортов в ранние сроки беременности, мертворождений, детей с пороками развития, хромосомной патологией; наличие структурных перестроек хромосом у одного из родителей; гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с аутосомно-рецессивным типом наследования; зона повышенного радиационного фона.

В настоящее время применяются непрямые и прямые методы пренатальной диагностики. При непрямых методах обследуют беременную (акушерско-гинекологические методы, сыворотка крови на альфа-фетопротеин), при прямых - плод.

К прямым методам, которые проходят без нарушения тканей, без хирургического вмешательства относится ультрасонография. К прямым методом, которые проходят с с нарушением целостности тканей – хорионбиопсия, амниоцентез, кордоцентез и фетоскопия.

Ультрасонография, эхография – это использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек, состояния плаценты.

На 5-й неделе беременности уже можно получить изображение оболочек эмбриона, к концу 6-й недели можно зарегистрировать его сердечную деятельность, а на 7-й неделе можно получить изображение и самого будущего ребенка.

В первые два месяца беременности УЗИ еще не позволяет выявить аномалии развития плода, но может определить его жизнеспособность. На 12 - 20-й неделе беременности уже возможна диагностика близнецовой беременности, локализации плаценты, отсутствия головного или спинного мозга, дефектов костной системы, закрытия невральной трубки, заращение естественных каналов желудочно-кишечного тракта.

Метод безопасен, поэтому продолжительность исследования не ограничена, и его можно применять повторно. При нормальном течении беременности проводят двукратное УЗИ, а при беременности с риском осложнений оно проводится с интервалами в 2 недели.

УЗИ плода обязательно при: наличии у родителей и ближайших родственников врожденных пороков развития; экстрагенитальных заболеваниях у беременной, например, гипертонической болезни, сахарного диабета, тиреотоксикоза, порока сердца, ожирения и др.; наличии мертворожденных детей, перинатальной смерти двух и более детей; угрозе прерывания беременности, кровотечении; недостаточной прибавке массы тела беременной; несоответствии размеров матки сроку беременности; многоплодии; фибромиоме матки.

В целом УЗИ позволяет получить данные о размерах плода (длина туловища, бедра, плеча, диаметр головы), о наличии у него дисморфии, о работе сердца, об объеме жидкости в зародышевой оболочке и размерах плаценты.

УЗИ позволяет обнаружить у плода и некоторые пороки развития. Например, отсутствие головного и спинного мозга, чрезмерное количество спинномозговой жидкости в полости черепа, аномалии структуры почек, неправильное развитие конечностей, легких, множественные врожденные пороки, пороки сердца, отек плода и плаценты.

Эхографияплаценты позволяет установить ее расположение, наличие отслойки ее отдельных участков, кисты, признаки старения, истончение или утолщение плаценты.

Допплеровское ультразвуковое сканирование, цветная допплерометрия отражают кровообращение плода.

ЯМР-томография плода позволяет выявить структурные аномалии, не обнаруживаемые при УЗИ, например, малые аномалии мозга, туберозный склероз, аномалии структуры почек и др.

Часто используют три метода исследования: уровня альфа-фетопротеина (особый эмбриональный белок), содержания хорионического гонадотропина (гормон, вырабатываемый плацентой в период беременности) и свободного эстриола (женский половой гормон) в крови женщины во 2-м триместре беременности. Отклонения этих показателей от нормы служат индикаторами высокого риска для плода.

Содержание альфа-фетопротеина в биологических жидкостях повышено при множественных пороках развития плода, спинномозговой грыже, чрезмерном количестве спинномозговой жидкости в области черепа, отсутствии головного или спинного мозга, пороках развития желудочно-кишечного тракта, дефектах передней брюшной стенки, аномалиях почек, фетоплацентарной недостаточности (недостаточной работе плаценты), задержке развития плода, многоплодной беременности, преэклампсии, резус-конфликте, вирусном гепатите В.

Концентрация альфа-фетопротеина в крови беременной снижена в случаях хромосомных болезней у плода, например, болезни Дауна, или наличия у беременной сахарного диабета I типа.

В настоящее время исследование альфа-фетопротеина проводится в 1-м триместре беременности одновременно с определением специфического для беременных белка А, что позволяет диагностировать болезнь Дауна и некоторые другие хромосомные аномалии у плода уже на 11 - 13-й неделях.

Хорионический гонадотропин (ХГ) определяется уже на 8 - 9-й дни после зачатия. При исследовании крови женщины во 2-м триместре беременности повышение уровня ХГ свидетельствует о задержке внутриутробного развития плода, высоком риске его гибели, отслойке плаценты, и о других видах фетоплацентарной недостаточности (нарушение работы плаценты).

Исследование уровня белка беременности I (Schwangerschaft protein I) в плазме крови женщин уже в 1-м триместре беременности служит индикатором хромосомных болезней плода.

Хорионбиопсия – это взятие ткани хориона (зародышевая оболочка). Проводится между 8-й и 10-й неделями. Ткань используется для цитогенетических и биохимических исследований, анализа ДНК. С помощью этого метода можно выявлять все виды мутаций (генные, хромосомные и геномные).

Значительным преимуществом хорионбиопсии является то, что она может быть использована на ранних этапах развития плода. Т. е. если выявятся отклонения в развитии плода и родители решат прервать беременность, то аборт на 10 – 12 неделе менее опасен, чем на 18 - 20-й неделе, когда становятся известны результаты амниоцентеза.

Амниоцентез – получение амниотической жидкости (жидкость вокруг зародыша) и клеток плода для анализа. Получение материала возможно на 16-й неделе беременности.

Основные показания для амниоцентеза общие: возраст беременной более 35 лет;нарушения нормы уровней альфа-фетопротеина, хорионичеокого гонадотропина и свободного эстриола в крови беременной;наличие нескольких серьезных факторов риска осложнений беременности.

Отдельные: мертворождения, перинатальная смертность;рождение предыдущего ребенка с хромосомными болезнями или с дисморфическими признаками;хромосомный сбалансированный мозаицизм у родителей;синдром ломкой Х-хромосомы у ближайших родственников;определение пола плода при риске наследственных Х-сцепленных заболеваний (гемофилия, иммунодефицит и др.);наследственные болезни обмена веществ;воздействие тератогенных агентов на организм беременной в критические периоды развития плода;задержка внутриутробного развития и дисморфия плода по данным УЗИ;риск внутриутробных инфекций (краснуха, цитомегалия, токсоплазмоз).

Осложнения при этом методе исследования не превышают 1 %.

Амниотическая жидкость используется для биохимических исследований, которые выявляют генные мутации. А клетки используются для анализа ДНК (выявляет генные мутации), цитогенетического анализа и выявления Х- и Y-хроматина (диагностирует геномные и хромосомные мутации).

Биохимические исследования амниотической жидкости могут дать ценную информацию. Например, диагностика адреногенитального синдрома (нарушения синтеза гормонов корой надпочечников и работы системы гипаталамус - гипофиз – яичники) у эмбриона возможна уже на 8-й неделе.

Исследование спектра аминокислот амниотической жидкости позволяет выявить некоторые наследственные болезни обмена веществ у плода, например, аргинин-янтарную ацидурию, цитруллинурию и др.

Исследование амниотической жидкости применяется для выявления хромосомных отклонений от нормы, определения активности ферментов.

Кордоцентез – взятие крови из пуповины. Материал используется для цитогенетических, молекулярно-генетических и биохимических исследований. Проводится с 18-й по 22-ю неделю.

Преимущество кордоцентеза по сравнению с амниоцентезом заключается в том, что берется кровь плода, что имеет решающее значение для диагностики внутриутробных инфекций, например, ВИЧ, краснухи, цитомегалии, парвовируса В19.

Однако показания для проведения кордоцентеза ограничены в связи с высоким риском осложнений, таких как внутриутробная гибель плода (до 6 %), недонашивание беременности (9 %).

Фетоскопия - осмотр плода фиброоптическим эндоскопом, введенным в зародышевую оболочку через переднюю стенку матки. Метод позволяет осмотреть плод, пуповину, плаценту и произвести биопсию.

Фетоскопия имеет очень ограниченное применение, т. к. сопровождается высоким риском прерывания беременности и технически сложна.

Современные технологии позволяют осуществлять биопсию кожи, мышц, печени плода. Материал используется для диагностики тяжелых наследственных заболеваний, например, генодерматозов, мышечных дистрофий, гликогенозов и др.

Риск прерывания беременности при применении методов пренатальной диагностики, нарушающих целостность тканей, составляет 1 - 2%.

Везикоцентез – прокол стенки мочевого пузыря плода для получения его мочи. Материал используется для исследования в случаях серьезных заболеваний и пороков развития органов мочевой системы.

Доимплантационная диагностика наследственных болезней стала возможной благодаря появлению экстракорпорального оплодотворения и использованию множественных копий эмбриональной ДНК.

Существует технология для выявления таких болезней, как Тея-Сакса, гемофилия, миодистрофия Дюшенна, фрагильная Х-хромосома и др. Однако она доступна немногим очень крупным центрам и дорого стоит.

Разрабатываются методы выделения клеток плода, циркулирующих в крови беременной, для проведения цитогенетических, молекулярно-генетических и иммунологических анализов.

Развитие и распространение методов пренатальной диагностики наследственных заболеваний позволят значительно снизить частоту наследственной патологии новорожденных.

Цитогенетические (кариотипические, кариотипические) методы используются, в первую очередь, при изучении кариотипов отдельных индивидов.

Суть этого метода заключается в изучении строения отдельных хромосом, а также особенностей набора хромосом клеток человека в норме и патологии. Удобным объектом для этого служат лимфоциты, клетки эпителия щеки и другие клетки, которые легко получать, культивировать и подвергать кариологическому анализу. Это важный метод определения пола и хромосомных наследственных заболеваний человека.

Основой цитогенетического метода является изучение морфологии отдельных хромосом клеток человека. Современный этап познания строения хромосом характеризуется созданием молекулярных моделей этих важнейших структур ядра, изучением роли отдельных компонентов хромосом в хранении и передаче наследственной информации.

Изменение кариотипа, как правило, связано с развитием генетических заболеваний. Благодаря культивированию клеток человека можно быстро получить достаточно большой материал для приготовления препаратов. Для кариотипирования обычно используют кратковременную культуру лейкоцитов периферической крови.

Цитогенетические методы используются и для описания интерфазных клеток. Например, по наличию или отсутствию полового хроматина (телец Барра, представляющих собой инактивированные X-хромосомы) можно не только определять пол индивидов, но и выявлять некоторые генетические заболевания, связанные с изменением числа X-хромосом.

Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников или плода при подозрении на хромосомный синдром либо другое хромосомное нарушение.

Кариотипирование – цитогенетический метод - позволяющий выявить отклонения в структуре и числе хромосом, которые могут стать причиной бесплодия, другой наследственной болезни и рождения больного ребенка.

В медицинской генетике имеют значение два основных типа кариотипирования:

изучение кариотипа пациентов
пренатальное кариотипирование - исследование хромосом плода

Цитогенетический метод изучения генетики человека. Определение Х- и У-хроматина. Значение метода для диагностики хромосомных заболеваний, связанных с нарушениями числа половых хромосом в кариотипе.

Определение Х- и Y-хроматина часто называют методом экспресс-диагностики пола. Исследуют клетки слизистой оболочки ротовой полости, вагинального эпителия или волосяной луковицы. В ядрах клеток женщин в диплоидном наборе присутствуют две хромосомы Х, одна из которых полностью инактивирована (спирализована, плотно упакована) уже на ранних этапах эмбрионального развития и видна в виде глыбки гетерохроматина, прикреплённого к оболочке ядра. Инактивированная хромосома Х называется половым хроматином или тельцем Барра. Для выявления полового Х-хроматина (тельца Барра) в ядрах клеток мазки окрашивают ацетарсеином и препараты просматривают с помощью обычного светового микроскопа. В норме у женщин обнаруживают одну глыбку Х-хроматина, а у мужчин её нет.

Для выявления мужского Y-полового хроматина (F-тельце) мазки окрашивают акрихином и просматривают с помощью люминисцентного микроскопа. Y-хроматин выявляют в виде сильно светящейся точки, по величине и интенсивности свечения отличающейся от остальных хромоцентров. Он обнаруживается в ядрах клеток мужского организма.

Отсутствие тельца Барра у женщин свидетельствует о хромосомном заболевании - синдроме Шерешевского-Тернера (кариотип 45, Х0). Присутствие у мужчин тельца Барра свидетельствует о синдроме Кляйнфелтера (кариотип 47, ХХY).

Определение Х- и Y-хроматина - скрининговый метод, окончательный диагноз хромосомной болезни ставят только после исследования кариотипа.

Цитогенетический метод

Цитогенетический метод используют для изучения нормального кариотипа человека, а также при диагностике наследственных заболеваний, связанных с геномными и хромосомными мутациями.
Кроме того, этот метод применяют при исследовании мутагенного действия различных химических веществ, пестицидов, инсектицидов, лекарственных препаратов и др.
В период деления клеток на стадии метафазы хромосомы имеют более четкую структуру и доступны для изучения. Диплоидный набор человека состоит из 46 хромосом:
22 пар аутосом и одной пары половых хромосом (XX - у женщин, XY - у мужчин). Обычно исследуют лейкоциты периферической крови человека, которые помещают в специальную питательную среду, где они делятся. Затем готовят препараты и анализируют число и строение хромосом. Разработка специальных методов окраски значительно упростила распознавание всех хромосом человека, а в совокупности с генеалогическим методом и методами клеточной и генной инженерии дала возможность соотносить гены с конкретными участками хромосом. Комплексное применение этих методов лежит в основе составления карт хромосом человека.

Цитологический контроль необходим для диагностики хромо- сомных болезней, связанных с ансуплоидией и хромосомными мутациями. Наиболее часто встречаются болезнь Дауна(трисомия по 21-й хромосоме), синдром Клайнфелтера (47 XXY), синдром Шершевского - Тернера (45 ХО) и др. Потеря участка одной из гомологичных хромосом 21-й пары приводит к заболеванию крови - хроническому миелолейкозу.

При цитологических исследованиях интерфазных ядер соматических клеток можно обнаружить так называемое тельце Барра, или половой хроматин. Оказалось, что половой хроматин в норме есть у женщин и отсутствует у мужчин. Он представляет собой результат гетерохроматизации одной из двух Х-хромосом у женщин. Зная эту особенность, можно идентифицировать половую принадлежность и выявлять аномальное количество Х-хромосом.

Выявление многих наследствен- ных заболеваний возможно еще до рождения ребенка. Метод пренатальной диагностики заключается в получении околоплодной жидкости, где находятся клетки плода, и в последующем биохимическом и цитологическом определении возможных наследственных аномалий. Это позволяет поставить диагноз на ранних сроках беременности и принять решение о се продолжении или прерывании.